聚丙烯酰胺凝胶
一、实验目的
1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
二、实验原理
带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。利用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分离率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N，Nˊ_甲叉双丙烯酰胺（N，Nˊ一Methylene bisacrylamide， Bis)，在引发剂（过硫酸铵，Ap）和催化剂（四甲基乙二胺， TEMED）的作用下聚合而成的。聚丙烯酰胺凝胶的基本结构是丙烯酰胺形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。电泳过程中，存在两种物理效应： 电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。 三、实验试剂和器材
1.试剂：分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 pH8.9）、Acr－Bis贮存液、0.14%过硫酸铵（新鲜配制）、TEMED、电极缓冲液pH8.3（用时稀释10倍）、40%蔗糖溶液（内含少量溴酚蓝）、染色液（考马斯亮蓝R-250） 、脱色液（7%冰乙酸溶液）。2.材料：人或动物血清。3.器材：垂直板电泳槽，直流稳压电源（电压300－600V，电流50－100mA），移液管（1，5，10ml），烧杯（25，50，100ml），细长头的滴管，1ml注射器以及6号长针头，微量注射器（10μL或者50μL），培养皿（直径120mm），玻璃板（13*13cm），玻璃纸两张，日光灯一台。 四、实验步骤
1.正确安装垂直板电泳槽
该图片来自互联网
2.制备凝胶板
3.加样 凝胶聚合后继续放置30min，双手轻轻去除样品槽模板用滤纸吸去残留液体。将玻璃板翻转重新放入并夹紧。内外槽中加入电极缓冲液，内槽液面没过短板0.5cm。取血清样品与40%蔗糖溶液（含少量溴酚蓝）1：1混合后，用微量注射器取10μL上述混合液，通过缓冲液，小心的将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。4.电泳 将直流稳压电泳仪的正负极与电泳槽装置的正负极分别连接，打开电泳仪开关，将电流调至15-25mA。5.染色 当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1cm时，将电流调回到零，关电源。剥出凝胶板，在胶板一端切除一角作为标记，滑入大培养皿。加入0.05%考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。6.脱色 倒出染色液，用7％乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。
图为学生实验所得结果
注意
1.Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠的半致死剂量为170mg/1kg，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。2.由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。3.凝胶完全聚合后，必须放置30min 至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
