细胞生物学翟中和
第一节：细胞形态结构的观察法
一、光学显微镜技术
①光学显微镜种类：普通光学显微镜技术、相差和微分干涉显微镜技术、荧光显微镜技术、激光扫描共焦显微镜技术、荧光共振能量转移技术、荧光漂白恢复技术；
②每种光学显微镜的特点：
分辨率
特点
效果
普通光学显微镜
最大0.2um
相差显微镜、微分干涉显微镜
可观察活细胞
很强立体感
荧光显微镜
观察特异蛋白质等生物大分子
观察的蛋白产生荧光
激光扫描共焦显微镜
比荧光显微镜高
减少焦平面以外的荧光
蛋白产生的荧光轮廓清晰
荧光漂白恢复
利用高功能级光束淬灭荧光
能够淬灭荧光，荧光恢复说明该部分蛋白在流动，而不是固定
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二、电子显微镜技术
（1）电子显微镜的基本知识：
?? ??①电子显微镜分辨率高的原因：使用了波长比可见光短得多的光源；
???? ②电子显微镜与光学显微镜的区别：
???????????? 光源?
分辨率
透镜
真空
成像原理
光学显微镜?? 可见光
200nm
?玻璃透镜
不要求真空
样品对光的吸收
电子显微镜?? 电子束
0.2nm
电磁透镜
高真空
样品对电子的散射和透射
???? ③电子显微镜样品处理：（具体见前面叙述的重点内容）
??????第一种常规流程：固定→包埋→超薄切片→染色
??????染色：某些精细结构可采用复染色技术。（重金属盐染色）
??????第二种流程（冷冻蚀刻电镜技术）：快速低温处理→样品低温断裂→喷镀铂金+碳(形成碳膜)→消化液消化样品→电镜观察碳膜上留下的痕迹及细胞断裂面结构
??????此方法适用于观察胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白。
（2）扫描电镜技术
???? 扫描电镜与普通电子显微镜的明显区别：立体感更强
???? 二者区别：
???? ????①成像原理：扫描电镜利用的是样品激发的二次电子，而不是直接散射光源
? ? ? ? ?? ②样品处理：扫描电镜为了使样品有良好的导电性，需要观察前喷镀一层金膜，而且为了降低在样品干燥时水的表面张力对样品表面结构的影响，需要用液态CO2进行处理再干燥。（原理p63）
第二节：细胞组分的分析方法
一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物
（一）差速离心
n? 特点：
n? 介质密度均一；
n? 速度由低向高，逐级离心(多次离心)
n? 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。
n? 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
n? 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
（二）密度梯度离心：
n? 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
n? 类型：速度沉降、等密度沉降。（区别看PPT）
n? 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
n? 分离活细胞的介质要求：
n? 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
n? 2）PH中性或易调为中性；
n? 3）浓度大时渗透压不大；
n? 4）对细胞无毒。
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二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法
属于生化内容，自行补脑
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三、细胞内特异核酸序列的定位与定性
原位杂交技术：利用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法。
n? Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
n? 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。
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四、放射自显影术
n? 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
n? 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，细胞中银颗粒所在的部位即代表放射性同位素的标记部位。
n? 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
五、流式细胞仪和细胞电泳
（1）流式细胞仪
n? 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
n? 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。
（2）细胞电泳：
n? 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。
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第三节：细胞培养、细胞工程与显微操作技术
一、细胞培养
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二、细胞工程
细胞融合（具体原理见前面所发的重点论述中的叙述）
n? 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。
n? 同核体：相同基因型的细胞融合而成。
n? 异核体：不同基因型的细胞融合而成。
n? 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。
n? 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。
n? 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。
?各显微镜对比：
光学显微镜
普通复式光学显微镜
可以直接用于观察单细胞生物或体外培养细胞
差相显微镜和微分干涉显微镜
可以观察活细胞显微结构的细节
荧光显微镜
染色体定位，细胞内动态变化的研究
激光扫描共焦显微镜
需要荧光染色，分辨率非常高
电子显微镜
超薄切片技术
固定-包埋-切片-染色
负染色技术
铺上重金属盐， ?显示细胞器、病毒等精细结构
冷冻蚀刻技术
观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征
电镜三维重构与低温电镜技术
研究三维结构
扫描电镜技术
二次电子，得到样品的立体图像信息
扫描隧道显微镜
可以在真空、大气、液体等多种条件下工作，非破坏性测量
